ELISA实验操作人员经常会遇到自己的检测数据和相关文献中的实验结果差别较大,甚至相反,或与预期不一致的情况,也常常为此感到困惑。博士德ELISA专家针对此现象给您答疑解惑。
引起ELISA测定结果与文献报导不一致的原因主要有三点:
1、标本因素
2、试剂因素
3、操作因素
一、标本因素血清是最常用的ELISA标本,血浆一般可视为与血清同等的标本,标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致,分为内源性物质和外源性物质两种:
内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质,可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。(1)类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合,从而导致假阳性。解决该情况的办法是:① F(ab)2替代完整的IgG;②标本用联有热变性(63℃,10 min)IgG的固相吸附剂处理(将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效);

③检测抗原时,可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中,使RF降解。

(2)补体

ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中,抗体分子发生变构,其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来,使C1q 可以将二者连接起来,从而造成假阳性。解决的办法是:①用EDTA稀释标本;②用53℃,10 min或56℃,30 min加热血清使C1q灭活。

(3)嗜异性抗体

人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体,可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,也能造成假阳性。解决的办法是:可在标本稀释液中加入过量的动物Ig (s),但加入量不足或亚类不同时无效。

(4)嗜靶抗原的自身抗体

抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体,有时能与靶抗原结合形成复合物,在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现,解决的办法是:测定前需用理化方法将其解离后再测定。

(5)医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体

临床开展的用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗,用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术,均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体;另外,被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig (s) 抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是:测定抗原时,在标本中加入足量的正常鼠Ig (s),从而克服由于上述原因造成的假阳性。

(6)交叉反应物质

类地高辛、类AFP样物质等,是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大,但在用单克隆抗体测定抗原时,如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时,也会出现假阳性结果。

(7)标本中其它成分的影响

血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等,均对ELISA测定结果有干扰作用。

外源性物质外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。●标本溶血由于各种人为原因引起的标本溶血,均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白,在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中,会导致非特异性显色,干扰测定结果。为克服上述干扰作用,标本采集时必须注意避免溶血。●标本活化有些细胞因子如EPCR在天然标本中未表露其抗原表位,需经酸处理使其抗原表位暴露,和检测抗体结合。●标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,因此,被细菌污染的标本同溶血标本一样,亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。●标本保存不当在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性;标本放置时间过长(如一天以上),有时抗原或抗体免疫活性减弱,亦可出现假阴性。为克服上述干扰,ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集;如不能立即测定,5天内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混合后再测定,但混匀时应轻柔,不可强烈振荡。●标本凝集不全在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下,正常血液采集后1/2~2h开始凝固,18~24h完全凝固。检验工作中,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;这类情况于次日复查时因血凝已完全,血清中不再有纤维蛋白原存在,故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用,解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

●标本管中添加物质的影响不同抗凝剂(如肝素,EDTA)的使用,会使血浆的检测结果存在一定差异。EDTA对金属离子结合蛋白的测定有影响。

●采血试管洗涤不彻底反复使用易交叉污染。

塑料试管能吸附抗原物质样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性,应选择优质塑料试管或玻璃管。

●组织样本处理组织样本一般使用裂解液或物理方法进行匀浆,裂解液中含有的化学试剂可能会产生一定的本底背景,需做阴性对照。特别需注意裂解液中是否含有蛋白变性剂SDS,SDS可能会影响抗原抗体的结合。

●细胞样本注意所培养的细胞来源是否经多次传代培养,多次传代的细胞样本会变异或产生其细胞亚种,使标志物的含量将会发生改变。有部分标志物和牛的同源性很高,在测标志物时需无血清培养,防止胎牛血清的干扰。

2、试剂因素
选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便的试剂。不同厂家的试剂不能混用,包括底物和洗涤液。不同厂家的试剂校准标准有差异,还有抗体,检测方法,试剂,交叉反应等因素都会导致采用不同厂家的试剂对样本的检测结果不一致。有的厂家酶标板孔间CV值大于20%,标记酶的活性及显色液的稳定性比较差,使用劣质的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。此外,还要注意试剂的批号和出厂日期,虽然试剂的有效期多为1年,最好选择刚出厂的试剂使用。有些厂家为了夸大生产ELISA的指标范围,用一种指标来冒充其它指标,造成各种种属,各种指标都可以做的假象。比如用TGF beta这样的指标代替大多数试剂盒的其它指标作为检测抗体,同样可以获得良好的标准曲线。因为TGF beta在大多数哺乳动物中(human, mouse, rat, pig, bovine, etc.)都有广泛表达,种属间的氨基酸序列同源性达100%,TGF beta 随着其他因子的影响,其表达水平也会发生相应的变化,使得客户难以查觉。鉴别方法如下:1.利用干扰实验可辨别ELISA试剂盒是否检测目的抗原。a)将针对试剂盒特异性的重组蛋白和试剂盒中的检测抗体配置成antibody:antigen=1:2的混合孵育液。b)37℃孵育15分钟后,代替原试剂盒中的检测抗体。c)后续操作按试剂盒说明书进行。d)如果标曲良好则说明加入的目的抗原和试剂盒抗体不匹配,试剂盒检测抗体针对的是非目的抗原,该试剂盒为伪劣产品;若标曲无线性,则说明检测抗体已被目的抗原中和或干扰,该试剂盒针对的是目的抗原。

2.如果购买了同一公司的ELISA试剂盒A和B,利用交叉实验可辨别ELISA试剂盒真伪。

a)取出试剂盒A的包被板两条。

b)一条加试剂盒A的标准品,另一条加试剂盒B的标准品。

c)后续操作按试剂盒说明书进行。

d)如果两条标曲一致说明两个试剂盒检测的同一指标而非A和B, 即为伪劣产品;若两条标曲不一致则说明两个试剂盒检测的是不同指标,即该产品为正常的ELISA试剂盒。

3.指标本身也可以鉴定试剂盒的真伪。某些指标从原理上来讲,免疫原性差,难以产生对应的抗体,不适合做ELISA。针对这样的指标,有些厂家也有相应的试剂盒出售。

有些厂家的部分试剂盒已被国内外学者鉴定假货,如果文献中使用的试剂盒来源于这些厂家,其检测结果可能有误。大家避免使用这些厂家的试剂盒的同时也要对参考文献中试剂盒来源格外留心,像博士德这种正规厂家生产的高品质的试剂盒才能为您的科研工作保驾护航。

博士德对ELISA产品进行严格质检,并提供详细数据

3、操作因素
●严格按照试剂说明书进行操作。●检测前应将试剂放置室温平衡半小时,洗涤液应现用现配,同时观察浓缩洗涤液中有无结晶,若有结晶应放37℃水浴中融化后方可使用。加入底物TMB时应注意有无颜色变化,若已显色则可能过期或变质,也不可使用。●加样后及时放入孵育箱。标本较多时,要分批操作。按照说明书步骤严格控制操作时间,防止孵育时间人为延长,导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底。●封板温育时,各孔一定要封严,防止阳性标本的液体蒸发,不会引起孔间的污染,产生周边现象从而导致“花板“的出现。●应保证酶标版清洁,整个操作过程中保证酶标版不接触次氯酸。加酶试剂后用吸水纸在酶标版表面轻拭吸干。合理安排检测量,以免反应板过多造成洗板等待时间长。

●用洗板机洗板时,保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完版后最好在吸水纸(选择干净,无尘的吸水材料)上轻轻拍干。若血清中的纤维蛋白或洗涤液中有结晶,将堵塞洗板机针孔,造成全堵或半堵状态,以致使未结合的酶标记物不能完全洗脱,而使最后底物显色时加深,造成假阳性或花板。废液瓶装满后应及时清空,以防止废液回流对管道的污染,而使洗涤不彻底,造成花板。洗板结束后应用蒸馏水彻底清洗管道,以防止废液在管道中的残留。洗涤次数及加液量不可完全按照试剂说明书设定,应根据本实验室的实际情况来设定,开展新项目前,应做好验证工作,根据洗涤的效果来决定洗涤的次数和加液量。同时应根据仪器维护保养程序,定期对洗板机进行维护保养

手动洗板时,加洗液要快速,没有多道移液器可以使用洗瓶。洗液应新鲜配制,以免被其他试剂污染,或染菌。加好洗液后浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速干脆。倒液后在吸水纸上拍板,选用无粉尘和碎屑的优质吸水纸。需要用力拍板,使孔内没有可见液体挂壁;但也不能太重,不能让样品干太久。酶标板拍干后立即做后续的加液。

加样量的准确与否,直接影响抗原抗体结合物的浓度,直至最后显色的深浅。吸嘴插入血清不可太深,若插入太深,吸嘴外壁可能粘连太多血清,轻微的抖动动即可将吸咀外壁的血清溅入其它包被孔中,造成交叉污染。加样时应尽可能的垂直加样,并加在包被孔的底部,不可加在孔的上部。标本量大时,可考虑使用排枪加试剂,可提高速度,但使用排枪时应注意吸嘴一定要装好,不可松动,否则会影响加样量的准确度。加样时保持显色剂不外流,显色剂应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。

加样时间间隔对结果也有一定的影响,在竞争抑制法试验中,理论上应该是标本与酶标抗体混合后同时加入反应孔,若标本先于酶标抗体加入反应孔,则标本会先与包被抗体进行反应,造成特异性假阳性。若是有干扰物质存在时表现明显,在公平条件下,干扰物质与包被抗体的结合能力会低于标本,而在非公平条件下,干扰物质会优先与包被抗体进行结合,出现假阳性。做HBcAb项目时,若标本与酶加样时间间隔太长,会引起吸光度的趋势性变化,会造成吸光度的降低。特别是针对临界值标本,出现假阳性。

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液,各种试剂盒的洗液不要混用。洗液需要稀释时,应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的超纯水或双蒸水,电导率小于1.5μS/cm,洗液如果结晶应待其溶解后配制。配制后要测定其pH值,使其范围在7.2-7.4之间。

4. 温浴因素
使用水浴箱作为温浴设备时,应注意水的深浅对结果的影响,当水浴箱中水的的实测温度37℃时,则水面温度可能只有34℃,空气温度更低,甚至只有二十多度,所以当水浴箱中水位过低时则酶标板微孔没有浸入水中,则反应温度会达不到37℃,相应的就会影响酶促反应。为防止边缘效应,酶标板应尽量浸入水中,以保证受热的均匀。水浴时,酶标板应封好,以免水滴滴入包被孔中,或阳性标本的蒸发。严格掌握温浴时间,不可为了早点出结果擅自缩短温浴时间。有研究表明,两次抗原抗体反应在37℃下,经1-2小时,产物可达顶峰。TMB经HRP作用后,约30分钟显色可达顶峰。随即逐渐减弱,至完全消退。
5. 酶标仪
酶标仪应安置在避光条件下,比色前应提前15-30分钟开机预热,这样测定结果会更稳定。为防止显色的加深或减弱,显色时间完成后应立即滴加终止液,并在10分钟内完成比色。比色前还应观察酶标板中包被孔是否都在一个平面,酶标板也应放平,以免引起酶标仪故障。酶标板从水浴箱取出后应擦净孔底水滴,若有水滴残留在孔底,全造成酶标仪读数错误。双波长测定时,不必要设空白孔,否则会引起测定的负值。
附1:样本稀释注意事项抗原抗体特异性反应时,生成结合物的量与反应物的浓度有关。无论在一定量的抗体中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗体,均可发现只有在两者分子比例合适时才出现最强的抗原-抗体反应。样本浓度和试剂不匹配会影响检测结果。样本要合理稀释,当标本中抗原含量较低时,如果稀释比例较大,则会使检测精确度降低。标本中抗原含量过高,如果稀释比例较小,则会产生Hook效应,得到假阴性结果。采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减少Hook 反应的发生。附2:移液器使用注意事项如较长时间不使用,要把移液枪的量程调至最大值的刻度,使弹簧处于松弛状态以保护弹簧,不注意此点容易导致活塞无法回弹。如果移液器每天都需要使用,则建议每三个月校准一次,若未经校准,则有可能引起较大的移液误差,影响检测结果。并用肥皂水或消毒乙醇,再用蒸馏水清洗,自然晾干清洁移液器步骤:(1)按说明书拆开移液器。(2)检查并擦拭灰尘和污迹。(3)只能用70%的乙醇擦拭,管嘴连件和推出器可浸泡在肥皂水或者异丙醇溶液中两小时。有替换滤芯的型号产品要及时更换脏掉的滤芯,以保证腔体内的清洁。(4)活塞、O形环和弹簧涂上硅油(没有硅油凡士林也可)。(5)装上并复原移液器。

综上所述,当ELISA测定结果与预期或文献报导中不一致时,应综合考虑标本因素,试剂因素和操作因素等多方面进行分析,并应采取相应措施排除干扰作用,从而为实验提供正确可靠的检测结果。