Caspase家族大起底


我们身体中成千上万的细胞可能在下一秒就会死去,这是正常的现象。清除受损的细胞,再用健康的细胞来代替,即人体细胞的持续更新的过程。然而,身体中的细胞必须认真选择哪个细胞将被清除。如果细胞受损,它们可能膨胀和破灭,污染周围的区域,身体对这种死亡的细胞反应会很强烈,发炎的部位将会涌入大量的血液,来清理这些死亡细胞。为了避免这种情况,身体的细胞能够快速,有效的将死亡的细胞清除干净.当细胞被给定信号,它们将自己的内部结构拆卸成小而且整齐的片段,进而凋亡。

细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程,Caspase家族是一组存在于细胞质中具有类似结构的半胱氨酸蛋白酶,它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键,至少已有14种Caspase被发现,与真核细胞凋亡密切相关,并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。
在人类,已经鉴定了11种不同的caspase,根据其蛋白酶序列的同源性可分为3个亚族:Caspase-1亚族包括 Caspase-1、4、5、11;Caspase-2亚族包括Caspase-2、9; Caspase-3亚族包括Caspase-3、6、7、8、10。起细胞凋亡执行者作用的caspase3、6、7。

细胞凋亡调控通路概览

在正常的细胞内,每一种caspase都是以非活性状态存在的,这种非活性的caspase称作酶原(zymogen),它是酶的非活性前体,其肽链比有活性时长一些,将多出的部分切除,就转变成有活性的caspase。
活化是有顺序的多步水解的过程,Caspase分子各异,但是它们活化的过程相似。首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽,然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基,由大亚基和小亚基组成异源二聚体,再由两个二聚体形成有活性的四聚体。去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步,也是必须的,但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽。

Caspase活化基本有两种机制,即同源活化和异源活化,这两种活化方式密切相关,一般来说后者是前者的结果,发生同源活化的Caspase又被称为启动caspase(initiator caspase),包括caspase-8,-10,-9,诱导凋亡后,起始Caspase通过adaptor被募集到特定的起始活化复合体,形成同源二聚体构像改变,导致同源分子之间的酶切而自身活化,通常caspase-8,10,2介导死亡受体通路的细胞凋亡,分别被募集到Fas和TNFR1死亡受体复合物,而Caspase-9参与线粒体通路的细胞凋亡,则被募集到Cyt c/d ATP/Apaf-1组成的凋亡体(apoptosome)。
同源活化是细胞凋亡过程中最早发生的capases水解活化事件,启动Caspase活化后,即开启细胞内的死亡程序,通过异源活化方式水解下游Caspase将凋亡信号放大,同时将死亡信号向下传递。
异源活化(hetero-activation)即由一种caspase活化另一种caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的经典途径。被异源活化的Caspase又称为执行caspase(executioner caspase),包括Caspase-3,-6,-7。执行Caspase不象启动Caspase,不能被募集到或结合起始活化复合体,它们必须依赖启动Caspase才能活化。
Caspase家族中,caspase1和caspase 11,以及可能还有caspase 4被认为不直接参与凋亡信号的转导,它们主要参与白介素前体的活化;而caspase 2,caspase 8,caspase 9和caspase 10参与细胞凋亡的起始;参与细胞凋亡执行的则是caspase 3,caspase6和caspase 7,其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制剂特异性,它们降解PARP,DFF-45(DNA fragmentationfactor-45),导致DNA修复的抑制并启动DNA的降解。而caspase-6的底物是lamin A和keratin 18,它们的降解导致核纤层和细胞骨架的崩解。

下面就让我们来一一了解下这14种半胱氨酸蛋白水解酶:

(一)Caspase-1
Caspase-1即ICE(IL-1转化酶,IL-1converting enzyme),是单核细胞合成的一种蛋白酶,可以将34kD的IL-1前体(pro-IL-1)剪切为17kD的成熟IL-1,这种剪切对于IL-1活性的发挥是必须的。不表达ICE的细胞系转化IL-1基因后可以产生pro-IL-1,但不能分泌有活性的成熟IL-1;ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的IL-1的分泌。ICE活性中心有高活性的巯基,对氧化剂很敏感,但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感。ICE本身可能不是人体细胞凋亡的真正效应剂,至少不是最主要的因素,在人体中可能有其它更重要的ICE样的蛋白酶参与细胞凋亡过程。

ICE基因定位于11q13-23,编码的ICE前体(pro-ICE)全长404aa,约45kD,蛋白酶活性中心是位于283~287位置的Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列,其中Cys285是发挥酶切活性的关键残基。在活化过程中pro-ICE在4个位点Asp103~Ser104、Asp119-Asn120、Asp297-Ser298和Asp316-Ala317进行自我催化剪切形成两个片段P20和P10,P20和P10首先形成异源二聚体,然后两个P20/P10异源二聚体再通过P10小亚基多聚化形成同源二聚体,所以ICE的活性形式是(P20/P10)2。pro-ICE活化过程中的剪切并不是在四个酶切位点同时进行的,最先被剪切的是第三个位(Asp297-Ser298),形成P35和P12两个片段,P35的酶切活性比pro-ICE要高,它既可以进一步在第三个酶切位点剪切其它pro-ICE,还可以剪切其它三个酶切位点,形成P20和P10两个片段,再由P20和P10形成四聚体。四聚体形式的ICE酶切活性非常强,实验证明即使在单核细胞大量分泌IL-1时,细胞浆中活性形式的ICE也仅占很小的比例。

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(二)Caspase-2
Caspase-2可以编码两个基因产物:ICH-1L长435aa,其中原结构域长123aa,301-305有以半胱氨酸为中心的活性位点QACRG,含有与ICE和CED-2相似的序列,分别有28%和27%同源性,高表达可引起哺乳动物细胞凋亡;另一种基因产物ICH-1S长312aa,高表达则能抑制细胞凋亡。ICH-1L促凋亡的作用可以被BCL-2所阻断,但不被CrmA所阻断。Northern Blot和反转录-PCR证实,caspase-2的表达与组织的发育阶段有关。ICH-1L和ICH-1S均表达于心脏、肾和脑,但ICH-1S在胚脑中表达最高,而ICH-1H在成年胸腺中表达最高。
在细胞发生凋亡时,48kDa的caspase-2首先被一种caspase-3样蛋白酶在Asp316剪切成p33和p14,然后再缓慢地在Asp152和Asp330处剪切为p18和p12组成的活性蛋白酶,后一过程要在2~3h后才能完成。caspase-2可能参与CTL细胞的杀伤作用,但它并不能被颗粒酶B直接活化,必须被一种caspase-3样蛋白酶活化。

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(三)Caspase-3
Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。Caspase-3正常以酶原(含有277个氨基酸残基,分子量约32kD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化过程中从Asp28~Ser29和Asp175~Ser176两处被剪切,形成P17(29-175)和P10(182-277)两个片段,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。
Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用,caspase-3基因转染昆虫Sf9细胞后引起细胞凋亡,这个过程可以被BCL-2阻断;在发生凋亡的细胞提取液中去除caspase-3后,这些提取液就失去了诱导细胞凋亡的能力;再加入纯化的caspase-3它就又恢复了致凋亡的功能。
Caspase-3可以被多种因素活化,在CTL细胞的杀伤作用中,它既可被Fas/FasL途径活化,也可以通过颗粒酶B途径活化。颗粒酶B是CTL细胞颗粒中的一种丝氨酸酯酶,是哺乳动物中caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶,它可以特异性剪切ICE家族蛋白酶催化亚单位C端的IxxD序列,并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。ICE也可以被颗粒酶剪切,但剪切后并不被活化。

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(四)Caspase-4
Caspase-4基因定位于人染色体11q22.2-22.3,所编码的蛋白包含377aa,分子量约43kD,一级结构与ICE有53%的同源性,在切除104aa的原结构域后同源性更高达60%,所有与酶活性中心(QACRG)和与结合底物有关的氨基酸残基都得到了保留。caspase-4分布较广,除脑组织外在所有检测的组织中都有表达。虽然caspase 4与ICE高度同源,但它并不能催化pro-IL-1为成熟分子,但可以活化ICE前体及其自身的前体。caspase 4不能剪切DNA-PK,ICE敏感的抑制剂YVAD-CHO可以阻断caspase 4的活性,但其敏感性仅为ICE的1/20。caspase-4的活性形式也是由P20和P10两种亚基组成。将caspase-4基因转染Sf9昆虫细胞系可以引起典型的凋亡变化,提示caspase-4在细胞凋亡中起一定的作用。

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(五)Caspase-5
Caspase-5包含418aa,分子量47.7kD,与ICE有51%的同源性,并具有保守的活性中心QACRG。但caspase-5不能剪切pro-IL-1,在过量表达时可以诱导凋亡的发生。

(六)Caspase-6
Caspase-6是通过搜索有保守的QACRG活性中心和GSWFI保守的抑制剂结合位点的方法用PCR的手段找到的,命名为Mch2,与caspase-3有38%同源性,可以在昆虫细胞中引起细胞凋亡。随后的研究证明,caspase 6可以剪切层蛋白B,而且其活性对Zn2+敏感,这是唯一一个可以剪切层蛋白的caspase。caspase识别的序列也是VEID。它不能剪切U1-70K和DNA-PK,但可以部分剪切PARP,并可活化caspase 3。

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(七)Caspase-7
Caspase-7是通过PCR扩增caspase保守序列得到的,包含304aa,分子量35kD,caspase-7是与caspase-3同源性最高的成员,有58%的同源性,与其它caspase有35%的同源性。caspase-7与caspase-3的同源区主要在具有酶活性的亚单位区,它也保留了QACRG(184-188)五肽活性中心,与底物结合的氨基酸残基也都存在。caspase-7可以分别在Asp23-Ala24、Asp198-Ser199和Asp206-Ala207之间被剪切,形成P20/P12形式的caspase-7。caspase-7分布很广泛,在脑中也有少量存在。
用Caspase-7基因转染乳腺癌细胞系发现全长蛋白不能引起细胞凋亡,但去除氨基端53aa (其中包括原结构域)的caspase-7则可以引起细胞凋亡。进一步研究证明去除原结构域的caspase-7具有自催化作用,可以自动催化成P10/P12形式。酶活性中心的半胱氨酸对caspase-7的这种作用十分重要,突变为Ala后就失去致凋亡作用。当Fas和TNF引起的细胞凋亡时细胞内caspase-7也被活化,CrmA可以阻断caspase-7引起的细胞凋亡。caspase 7不能剪切pro-IL-1,但它可以剪切PARP和固醇调节元件,caspase-7对PARP的剪切可以被DEVD-CHO所阻断,但不能被ICE敏感的YVAD-CHO所阻断。caspase-7对DEVD-CHO抑制剂的敏感性只有caspase-3的1/3,对CrmA则很不敏感。

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(八)Caspase-8
Caspase-8前体共有479aa,分子量为55kD,其显著的特点是在N端有2个70aa左右的结构域,与FADD的N端的死亡效应结构域(deatheffector domain, DED)同源,这种同源的结构域可以发生相互聚合,提供了caspase-8与FADD相互结合的一个部位。caspase-8的C端与ICE结构同源,它的活性中心与其它ICE家族蛋白酶活性中心有所不同,不是通常的QACRG,而是由QACQG五肽组成,但这样的结构不影响其蛋白酶活性的发挥。caspase-8一级结构中其它与结合底物有关的氨基酸残基都很保守。caspase-8分布于胎儿和成人的各种组织中,但在胎脑中没有分布。在外周血白细胞中水平较高,可能与白细胞的凋亡有关。
Caspase-8可以自我活化,也可以在颗粒酶B的剪切下活化。caspase 8特异性识别的序列是DEVD,活化的caspase-8不但可以剪切PARP,而且还参与其它ICE家族蛋白酶,如caspase-3和caspase-7的活化过程。用caspase-8基因转染MCF-7乳腺癌细胞系,可以引起细胞凋亡,出现典型的形态变化。caspase-8引起的细胞凋亡可以被广谱的ICE家族蛋白酶抑制z-VAD-fmk所阻断,也可以被CrmA阻断,提示它可能是CrmA的靶蛋白。
由于caspase-8具有FADD样DED结构域,并且能够通过DED结构域与FADD结合,所以caspase-8可以在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系,从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。他们认为,在非活化情况下caspase-8的两个FADD样DED结构是互相结合在一起的。当细胞膜表面的Fas与其配体FasL或相应的单抗结合后,受体发生多聚化,引起FADD与受体胞浆区死亡结构域互相结合。这种结合使FADD的DED结构域发生变构,变构后的DED可以与胞浆中caspase-8的一个DED结构域结合,使caspase-8的两个DED结构域分开,同时使caspase-8的ICE同源区解放出来,恢复蛋白酶活性,通过自我催化生成活性形式的caspase-8蛋白酶,后者再作用于胞浆中其它ICE家族蛋白酶,使它们发生逐级活化。

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(九)Caspase-9
Caspase-9分子量46kD。序列分析表明它也属于ICE/CED-3家族,在相当于ICE活性部分的序列中,caspase-9与其它成员有30%左右的同源性,它的原结构域很长,与caspase-3相似。在caspase-9中与结合底物有关的6个氨基酸残基都得到了保留,但它的酶活性中心的五肽序列与其它ICE/CED-3蛋白酶的QACRT不同,是QACGG,这是继caspase-8的QACQG之后出现的另一种活性中心变异,这种变异也不影响蛋白酶的酶切活性。
Caspase-9是凋亡的引发剂,即开始凋亡过程。它接收信号开始起作用,活化,然后激发效应Caspase来进行削减。效应Caspase可以是Caspase-3.然后与其它的效应Caspase来一起进行拆分细胞的工作。

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(十)Caspase-10
Caspase-10含有497aa,分子量55kD,与其它成员有30-50%的同源性。caspase-10分子结构的显著特点是其N端也有两个FADD氨基端样结构域,所以它也可能与caspase-8一样是将细胞膜事件转化为细胞浆事件的一个环节。caspase-10的酶活性中心也与caspase-8一样,是QACQG,而不是一般的QACRG五肽序列。caspase-10分布广泛,基因定位于2p12,基因转染昆虫细胞系Sf9中可以引起细胞凋亡,其活性可以被DEVD-CHO所抑制。

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(十一)Caspase-11
Caspase-11,373aa,42kDa,与ICE有46%同源性,活性中心为QACRG,ICE中与催化活性有关的氨基酸残基得到了保留,包括His206、Gly207和Cys254,与P1结合有关的氨基酸残基也保守,包括Arg148、Gln252、Arg310和Ser316。caspase-11表达于许多组织,与ICE表达模式相似,并可以被LPS所诱导。在Rat-1细胞中过量表达caspase-11可以引起细胞凋亡,CrmA和BCL-2可以阻断这种凋亡。caspase-11可以被颗粒酶B剪切并活化。caspase-11虽不能剪切IL-1前体,但可以活化ICE,通过ICE再活化IL-1。所以在细胞凋亡中,caspase-11可能作用于ICE上游,在受LPS刺激后首先活化,然后再通过活化ICE,一方面剪切IL-1,引起炎症反应,另一方面还可以在有些细胞中引起细胞凋亡。

(十二)Caspase-12
Caspase-12,341aa,39kDa,它与Caspase-1和caspase家族的其他成员密切相关,被称为炎性Caspase,其主要功能是加工和激活炎症细胞因子如白细胞介素1和白细胞介素18。

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(十三)Caspase-13
Caspase-13,377aa,43kDa,是牛来源的蛋白质,其在C-末端天冬氨酸残基处切割它们的底物。虽然这种酶最初报告为是可以被Caspase-8激活的人半胱氨酸蛋白酶,但后来的研究证实,确定Caspase-13的基因来自牛,可能是人类Caspase-4直系同源的基因。

(十四)Caspase-14
Caspase-14,142aa,27kDa,在细胞凋亡的执行阶段中起着中心作用。Caspase-14作为无活性前体存在,其在保守的天冬氨酸残基处进行蛋白水解加工以产生两个亚单位,大和小,二聚形成活性酶。Caspase-14具有异常短的前结构域,并且在胚胎组织中高度表达,但除了皮肤以外的大多数成体组织中不存在。Caspase-14已经被描述为在体内由抗Fas激动剂抗体或TNF相关的细胞凋亡诱导配体加工和活化。这种胱天蛋白酶的表达和加工可以参与角质形成细胞末端分化,其对于皮肤屏障是必需的。

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Caspase家族的研究,对于了解细胞凋亡途径及各种相关疾病的诊治和药物的开发有重要作用。

博士德生物提供研究Caspase家族蛋白的一系列应用于组织化学,免疫印迹的一抗和相关辅助试剂,以及ELISA试剂盒。